Un antibiogramme avec des produits de substitution

Liaison avec le programme

Niveau concerné : 1ère S
Partie du programme : Thème 3 : corps humain et santé - 3B – Variation génétique et santé
Sous-partie 3-B-c : Variation génétique bactérienne et résistance aux antibiotiques

Des mutations spontanées provoquent une variation génétique dans les populations de bactéries. Parmi ces variations, certaines font apparaître des résistances aux antibiotiques
Pratiquer une démarche scientifique.

Manipuler et expérimenter.

Concevoir et mettre en place un protocole permettant de montrer la sensibilité de microorganismes à différents antibiotiques.

Recenser, extraire et organiser des informations pour :
- identifier la sensibilité ou la résistance de microorganismes à différents antibiotiques,
- calculer le taux d’apparition de résistances dans une population.

Problème à résoudre

Comment identifier une souche résistante ?
Comment expliquer son apparition ?

Pourquoi des produits de substitution ?

Deux raisons à cela :
-  la manipulation de souches de microorganismes ne doit se faire que dans des conditions bien contrôlées. Or tous les laboratoires de lycée ne sont pas formés et/ou équipés pour exercer ce contrôle, en particulier pour la destruction des souches après manipulation,
-  l’exposition à des antibiotiques contribue au développement de souches résistantes (c’est ce que le programme demande de montrer). Il y en a bien assez comme cela sans que toutes les 1ères S de tous les lycées de France exposent des bactéries à des antibiotiques.
On pourra d’ailleurs après coup discuter avec la classe des raisons qui ont amené l’enseignant à choisir des produits de substitution plutôt que de vraies souches de bactéries et de vrais antibiotiques.

Deux avantages supplémentaires par rapport à la réalisation d’un antibiogramme, en plus de la sécurité :
-  le coût,
-  le temps : le résultat est visible au bout de seulement quelques minutes.

Protocole de substitution

Ce protocole est adapté à partir de celui proposé sur le site e-Bug dans la partie collège (sur lequel se trouve aussi une activité ludique sur la transmission des IST)

- Principe

Un indicateur coloré sensible au pH remplace les bactéries. De l’acide chlorhydrique remplace l’antibiotique.

- Matériel :

  • Boîtes de Pétri (le nombre dépend de la construction de la séance)
  • Acide chlorhydrique
  • Marqueur
  • Gélose (agar)
  • Tubes à essai
  • Pinces fines
  • Portoirs
  • Pastilles de papier filtre (préparées par exemple avec un perforateur de bureau sur du papier filtre plié pour avoir plus d’épaisseur)
  • Rouge phénol à 2-4%

- Préparation des boîtes de gélose (agar)

  1. Préparer la gélose (agar) selon les instructions du fabricant.
  2. Lorsqu’il est légèrement refroidi, mais pas encore solidifié, verser dans une boîte (pour pouvoir montrer aux élèves la couleur indiquant l’absence de croissance bactérienne).
  3. Ajouter ensuite suffisamment ( 10 gouttes) de rouge phénol à 2-4% pour que l’agar prenne une couleur rouge orangée (représentant la croissance bactérienne) et bien mélanger.
  4. Verser dans chaque boîte de Pétri et laisser refroidir.

A la place du rouge phénol, on peut utiliser de la phénolphtaléine : 2,5g pour 100mL d’éthanol 95° additionné de rouge Congo.

- Manipulation élèves :
Les élèves disposent de tubes à essais portant le nom de différents antibiotiques et contenant en réalité de l’acide chlorhydrique (5%) ou de l’eau.
Avec la pince fine, une pastille de papier filtre est trempée dans un des tubes à essai puis déposé sur la gélose en suivant le schéma ci-dessous :

Le protocole initial du site e-bug propose de trouer la gélose à l’emporte pièce et de déposer l’antibiotique/HCl avec une pipette compte-gouttes (un peu comme dans le protocole d’Ouchterlony).
Nous proposons de déposer une pastille de papier filtre imbibée d’HCl pour que le geste se rapproche davantage de la réalisation d’un véritable antibiogramme.

Mise en situation et place dans la démarche

- 1ère proposition : mettre l’élève en situation de choix de traitement de patients.
Chaque boîte correspond à un patient et il faut par l’antibiogramme déterminer quel traitement sera efficace, c’est à dire à quel(s) antibiotique(s) la bactérie résiste ou non.

Chaque binôme pourra avoir un patient différent. Il suffit de changer ce qui est noté sur les tubes avec HCl ou avec l’eau selon le cas.

On est ici au début de la démarche, dans l’observation d’un phénomène (l’apparition de résistances aux antibiotiques) qu’il s’agira d’expliquer.

- 2ème proposition (adaptée à partir du livre de 1ère S Belin) : mettre l’élève en situation de vérification de l’hypothèse qu’il s’est produit une ou des mutations qui sont à l’origine des résistances aux antibiotiques.
Les résistances doivent donc apparaître aléatoirement au fil des générations successives.

L’expérience est la suivante : on prend une souche de bactérie non résistante. Une partie est congelée pour conservation. Le reste est divisé en plusieurs lots (un par binôme) qu’on laisse se multiplier.
Le jour du TP on teste la résistance aux antibiotiques des différents lots pour voir si des résistances sont apparues. On fait aussi le test sur la souche initiale, décongelée.

Le binôme chargé de la souche initiale aura de l’HCl dans tous ses tubes : la souche est sensible à tous les antibiotiques.
Pour les autres binômes, un ou plusieurs tubes contiendront de l’eau pour montrer l’apparition d’une résistance.
La concentration en HCl pourra être différente (par exemple un tube à 5% et un autre à 0,5%), ce qui laissera une tache plus ou moins large, montrant une sensibilité plus ou moins grande.

Pour illustrer le caractère aléatoire de la mutation et donc de l’apparition de la résistance, certains binômes pourront avoir des souches restées sensibles à tous les antibiotiques.
La résistance apparue ne sera pas la même pour tous les binômes.

On est ici dans le test d’une hypothèse. La résistance aux antibiotiques a déjà été défini et on cherche à valider l’explication donnée (apparition par mutation).

Exemples de boîtes obtenues

Prolongements

- on peut utiliser différentes concentrations en HCl qui laisseront une décoloration plus ou moins étendue sur la gélose, témoignant d’une sensibilité plus ou moins grande des bactéries à l’antibiotique.
Une capture d’image permettra la mesure du diamètre de chaque zone dans le logiciel Mesurim, par une mesure de surface.

- Utilisation de Rastop et Anagène :

  • fichier montrant la céfotaxime sur la betalactamase
  • fichier .edi donnant la séquence du gène de la betalactamase d’une souche d’E. Coli sensible et d’une souche résistante à la céfotaxime.
    fichiers céfotaxime

Sources :

- Voir aussi : Mettre en œuvre un protocole pour déterminer le taux de mutation chez E. Coli

F. Redon, B. Boucher

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